Реакция агглютинации, ее разновидности, способы постановки, применение. Лекция по микробиологии "Иммунные реакции

/ 50
ХудшийЛучший

В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроцита и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

В зависимости от вида используемого иммунодиагностикума различают реакцию микробной агглютинации, гемагглютинации, латекс-агглютинации, коагглютинации и т. д.

Для диагностики инфекционных заболеваний реакцию агглютинации проводят в двух направлениях: определяют вид выделенного от больного микроба-возбудителя с помощью диагностической агглютинирующей сыворотки (серологическая идентификация микроба) и обнаруживают специфические антитела в сыворотке больного, используя стандартный микробный диагностикум (серодиагностика заболевания, постановка серологического диагноза).

Различают прямую и непрямую реакции агглютинации

Реакция прямой агглютинации микробов (РА). В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютаногены). Обычно они представлены взвесью инактивированных микроорганизмов (реакция микробной агглютинации). По характеру образующегося агглютината различают зернистую и хлопьевидную агглютинацию. Зернистая агглютинация происходит при склеивании микробов, содержащих О-антиген. Бактерии, имеющие жгутики (Н-антиген), агглютинируются с образованием крупных хлопьев.

Для определения вида микроорганизмов используют стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки. Их получают гипериммунизацией лабораторных животных взвесью бактерий. Титром такой сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена. Однако из-за сложности антигенной структуры бактерий, агглютинирующие сыворотки содержат антитела не только к видоспецифическим, но и к групповым антигенам и могут давать групповую агглютинацию с родственными видами бактерий. Титры антител к видоспецифическим антигенам в сыворотке всегда выше, чем к групповым. Для удаления группоспецифических антител в сыворотку последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят групповые антигены (метод Кастеллани). Таким методом получают адсорбированные сыворотки, которые содержат антитела к определенному виду микроба.

Методы реакции агглютинации. Наиболее распространены пластинчатая (ориентировочная) и развернутая РА. Пластинчатую РА ставят на стекле. В этой реакции используют сыворотки с небольшим разведением или неразведенные. Используют ее как ускоренный метод обнаружения антител или идентификации микроорганизмов. На стекло наносят каплю сыворотки, в которую петлей вносят неизвестную культуру бактерий, перемешивают и через 2-3 минуты наблюдают появление мелкозернистой или хлопьевидной агглютинации. Для контроля используют каплю физиологического раствора, в которой после внесения бактерий наблюдается помутнение. При использовании неадсорбированных сывороток реакция на стекле имеет только ориентировочное значение.

Развернутую РА проводят в пробирках или лунках пластин. При этом диагностическую сыворотку разводят до титра и вносят одинаковые количества антигена. При положительном результате на дне пробирки образуется рыхлый осадок в виде " зонтика", при отрицательном - осадок в виде " пуговицы". Поскольку титры группоспецифических антител в сыворотке значительно ниже, чем титр видоспецифических, групповые реакции наблюдаются лишь в небольших разведениях сыворотки. Если агглютинация происходит до титра или до половины титра сыворотки, она является видоспецифэтеской.

Для определения антител в сыворотке больного (серологический диагноз) используют стандартный микробный диагностикум, содержащий взвесь известных микробов или их антигенов. В этом случае также можно ставить пластинчатую и развернутую РА.

Реакция прямой агглютинации клеток. Для определения групп крови используют стандартные сыворотки крови доноров, содержащие известные анти-А или анти-В антитела. Реакции ставят на стекле или пластинах. При наличии на эритроцитах А (2-я группа крови), В (3-я группа крови) или обоих антигенов (4-я группа крови) соответствующие сыворотки агглютинируют эритроциты. Применяется также проба на совместимость крови, когда капли крови донора и реципиента смешивают и оценивают агглютинацию.

В клиниках применяют реакцию агглютинации лейкоцитов, тромбоцитов и других клеток для выявления аутоантител, а также для определения антигенов на этих клетках.

Реакция непрямой (пассивной) агглютинации. Для получения феномена агглютинации антиген предварительно адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, целлюлоза, полистирол, оксид бария и др.) или клетки (эритроциты барана, I(0)-группы крови человека).

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный антигенный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика, установление серологического диагноза). Если нагрузить эритроциты антителами, то их можно применять для выявления антигенов.

Прямая и непрямая антииммуноглобулиновые реакции Кумбса. Используются для выявления " неполных" (неагглютинирующих) антител, которые образуются при различных заболеваниях: резус-конфликте, аутоиммунных заболеваниях, некоторых инфекциях. Для постановки этих реакций необходима антиглобулиновая сыворотка, которую получают путем иммунизации кролика иммуноглобулинами человека. Такая сыворотка содержит полные (бивалентные) антитела-антииммуноглобулины.

Прямая реакция: к отмытым эритроцитам крови больного добавляют антииммуноглобулиновую сыворотку. Если на эритроцитах есть неполные антитела (иммуноглобулины), что наблюдается при гемолитической анемии, резус-конфликте (эритроциты плода), то они агглютинируются.

Непрямая реакция выявляет свободные антиэритроцитарные антитела в сыворотке крови больного. К этой сыворотке добавляют отмытые эритроциты донора 0(I) группы крови. Смесь инкубируют при 37°С в течение 30 минут и отмывают эритроциты. Затем к ним добавляют антииммуноглобулиновую сыворотку. Если в сыворотке больного были неполные антиэритроцитарные антитела, то наступит агглютинация.

Реакция агглютинации (РА) - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита. Образовавшийся осадок называют агглютинатом.

РА используют:

1. Для обнаружения антител в сыворотке крови больного (серодиагностика).

2. Для определения вида и серовара выделенной от больного чистой культуры патогенных микроорганизмов (серотипирование).

Реакцию агглютинации используют для определения антител в сыворотке крови больных, например, при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), бруцеллёзе (реакции Райта, Хеддлсона), туляремии, лептоспирозах и других инфекционных болезнях, а также для определения выделяемого от больного возбудителя (кишечные инфекции, коклюш и др.). РА применяется для определения групп крови, резус - фактора и др.

Для реакции необходимы следующие компоненты:

1. Антиген (агглютиноген) должен быть корпускулярным, то есть это взвесь живых или убитых микроорганизмов (диагностику м), эритроцитов или других клеток. Обычно используют суточную культуру микроорганизмов, выращенную на скошенном агаре. Культуру смывают 3 - 4 мл изотонического раствора, переносят в стерильную пробирку, определяют густоту. Взвесь должна быть гомогенной и содержать до 3 млрд. микробных клеток в 1 мл. Применение взвеси убитых микробов - диагностикумов - облегчает работу (готовятся на производстве).

2. Антитела (агглютинины) находятся в сыворотке больного (при серодиагностике) или в агглютинирующей сыворотке (при серотипировании). Агглютинирующие сыворотки получают путём иммунизации кроликов убитыми бактериями.

Титром агглютинирующей сыворотки называется наибольшее её разведение, в котором на реагирует с соответствующим антигеном в определённых условиях опыта.

Агглютинирующие сыворотки могут быть нативными (неадсорбированными) и адсорбированными. Нативные сыворотки в небольших разведениях взаимодействуют не только с тем видом микроорганизмов, которым иммунизировали животное для получения сыворотки, но и с родственными видами микроорганизмов, т. к. в них присутствуют групповые антитела (антитела к микроорганизмам, имеющим общие антигены). Нативные сыворотки используются для развёрнутой реакции агглютинации (при серодиагностике), где учитывается не только наличие реакции, но и динамика нарастания титра антител.

Если из нативной сыворотки извлечь (адсорбировать) групповые антитела путём взаимодействия с родственными бактериями, имеющими групповые антигены, получаются адсорбированные сыворотки. Адсорбированные сыворотки могут быть монорецепторными (или типоспецифическими), содержащими антитела только к одному антигенному рецептору, Поливалентные сыворотки состоят из смеси нескольких адсорбированных или неадсорбированных сывороток. Адсорбированные сыворотки используют для реакции агглютинации на стекле.

При иммунизации животных подвижными бактериями с Н-антигеном получают Н-агглютинирующие сыворотки, содержащие Н-антитела (например, сальмонеллёзная монорецепторная Н-агглютинирующая сыворотка). Иммунизацией О-антигеном получают О-агглютинирующие сыворотки, содержащие О-антитела, (например, сальмонеллёзная групповая адсорбированная О-агглютинирующая сыворотка, противохолерная О-агглютинирующая сыворотка). Иммунизацией Н- и О-антигенами получают сыворотки с Н- и О -антителами.

Причём О-агтлютинины дают мелкозернистый агглютинат, а Н-агглютинины - крупнохлопчатый осадок.

3. Электролит - изотонический раствор NaCl (0,9 % раствор хлорида натрия, приготовленный на дистиллированной воде).

Существует два основных метода постановки реакции агглютинации: реакция на стекле (иногда ее называют ориентировочной или пластинчатой) и развернутая реакция (в пробирках)

Постановка реакции агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капели сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Диагностическая агглютинирующая сыворотка берётся в одном разведении, которое в зависимости от её титра составляет 1:10, 1:25, 1:50 или 1:100. В одну из капель сыворотки и каплю изотонического раствора петлей вносят культуру исследуемого микроорганизма и тщательно перемешивают. Капля хлорида натрия с микроорганизмами - контроль антигена, капля сыворотки без микроорганизмов - контроль сыворотки. Нельзя переносить культуру из капли с сывороткой в каплю с NaCl. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остается прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерное помутнение, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината, то результат считают положительным. Если в капле с сывороткой и антигеном равномерное помутнение, то это отрицательный результат. Реакция отчётливее видна на тёмном фоне.

Сыворотка

1. контроль антигена

2. контроль сыворотки

Цель: Владеть техникой постановки реакции агглютинации и реакции преципитации для диагностики инфекционных заболеваний.

Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция. Иммуни-тет.

Тема 16: Реакция агглютинации. Реакция преципитации.

Актуальность темы. Под иммунитетом подразумевают невосприимчивость организма к инфекционным и неинфекционным агентам (патогенных микроорганизмов, чужеродных белков и др. веществ). Эти агенты получили названия антигенов. Иммунитет бывает врожденным и приобретенным. Врожденный – когда формируются тканевые и гуморальные защитные приспособления, обуславливающие невосприимчивость к инфекционным заболеваниям, передающимся по наследству.

Приобретенный – осуществляется иммунной системой организма в виде выработки антител или накопления сенсибилизированных лимфоцитов. Он подразделяется на естественный и искусственный . По механизму действия разделяется на активный и пассивный . Во всех иммунологических реакциях основным компонентом является антиген.

Основной функцией иммунной системы, которая состоит из лимфоидной ткани, является распознавание чужеродных агентов (антигенов) и обезвреживание их.

Антигены могут попадать в организм через дыхательные пути, пищеварительный тракт, через кожные и слизистые покровы. Каждый антиген стимулирует образование особых белковых веществ – антител.

Антигены подразделяются на полноценные и неполноценные (гаптены). Полноценные антигены вызывают полный иммунный ответ. Неполноценные антигены самостоятельно не вызывают иммунного ответа, но иногда приобретают эту способность при конъюгации с высокомолекулярными белковыми носителями. Кроме того, бывают антигены: полугаптены, проантигены, гетероантигены и изоантигены.

Антитела представляют собой иммуноглобулины сыворотки крови человека или животного. Образуются антитела после перенесенной инфекции, и в результате иммунизации ослабленными или убитыми бактериями, риккетсиями, вирусами, токсинами и другими агентами. Антитела – белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам. По структуре и иммунобиологическим свойствам иммуноглобулины подразделяются на 5 классов : IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Нормальные антитела обнаруживают у людей и животных не иммунизированных. Специфические антитела образуются в результате перенесенной инфекции или же иммунизации.

Реакции взаимодействия антитела с антигеном называются серологическими . Серологические реакции отличаются высокой специфичностью и применяются при диагностике многих инфекционных заболеваний. Различают реакции агглютинации и преципитации.

1. Реакция агглютинации (РА) основана на взаимодействии антигена (агглютиногена) и антитела (агглютинина), при котором происходит склеивание и выпадение в осадок микробных тел в присутствии электролита. Существуют различные модификации постановки реакции агглютинации.

Наибольшее значение имеют:

- Макроскопическая (развернутая) агглютинация в пробирках. К сыворотке больного добавляют взвесь микробов (диагностикум) и через 1 час в термостате при температуре 37 градусов отмечают разведение (титр) сыворотки, при котором произошла реакция. Положительной считают реакцию агглютинации тогда, когда на дне пробирки образуется осадок с выраженным просветлением надосадочной жидкости. Этот осадок называется агглютинатом.

По характеру агглютината различают мелкозернистую (О) и крупнозернистую (Н) агглютинацию. Для выявления мелкозернистого агглютината пользуются агглютиноскопом. Учет результатов начинают с контрольных пробирок. Последнее разведение сыворотки, в которой наблюдается агглютинация, считают ее титром.

Цель реакции: обнаружение антител в сыворотке больного.

- Микроскопическая (ускоренная) ориентировочная агглютинация на стекле. К капле диагностической иммунной сыворотки вносят каплю бактериальной культуры и равномерно перемешивают. Реакция протекает при комнатной температуре через 5-10 минут. Затем производят учет. При положительной реакции в капле с сывороткой отмечают скопление бактерий в виде зернышек или хлопьев. Цель реакции: определение вида возбудителя по известной диагностической сыворотке.

- Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). Сущность этой реакции заключается в том, что эритроциты барана способны адсорбировать на своей поверхности антигены. Под воздействием специфических антител, эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне гемагглютинат. Реакция отличается высокой чувствительностью и специфичностью. РНГА позволяет обнаружить минимальное количество антител и неполноценные антигены полисахаридной природы. Эту реакцию применяют при диагностики многих инфекционных заболеваний (брюшного и сыпного тифа, паратифов, туберкулеза и др.).

2. Реакция преципитации (РП) – осаждение комплекса антиген-антитело. Основным отличием РП от РА является то, что при РА применяется корпускулярный антиген, а при РП – антиген представляет собой коллоидное вещество белковой или полисахаридной природы. В этой реакции антиген называется преципитиноген, а антитела – преципитины. Реакцию ставят в пробирках наслоением раствора антигена на иммунную сыворотку. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе

этих растворов образуется кольцо преципитата. Если в качестве антигена используют прокипяченные и профильтрованные экстракты органов и тканей, реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, которую ставят при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии и др.).

Широкое распространение получили реакции преципитации в агаре: метод простой диффузии, метод двойной диффузии .

Разновидностью преципитации является реакция флокуляции – для определение активности анатоксина или антитоксической сыворотки. Кроме того, можно использовать эту реакцию для определения токсигенности штаммов Corynebacterium diphtheriae.

Конкретные цели:

· Объяснить роль антигенов, как индукторов иммунного ответа;

· Описать структуру антигенов, в том числе антигенов микроорганизмов;

· Описать механизм реакции агглютинации;

· Описать механизм реакции преципитации.

Уметь:

· Пояснить роль антигенов, как индукторов иммунного ответа;

· Описать структуру антител (разных классов иммуноглобулинов);

· Проанализировать механизм взаимодействия антител с антигенами;

· Трактовать результаты реакции агглютинации;

· Трактовать результаты реакции преципитации;

· Анализировать полученные результаты.

Теоретические вопросы:

1. Определение понятия «антигены», «антитела».

2. Роль антигенов как индукторов иммунного ответа.

3. Структура антител (разных классов иммуноглобулинов).

4. Механизм взаимодействия антител с антигенами.

5. Реакции иммунитета, их роль в иммунном ответе и диагностике инфек-ционных болезней.

6. Механизм реакции агглютинации.

7. Механизм реакции преципитации.

Практические задания, которые выполняются на занятии:

1. Постановка реакции агглютинации для выявления антител в сыворотке больного.

2. Постановка реакции микроагглютинации на стекле с диагностическими сыворотками для идентификации чистой культуры бактерий.

3. Оценка результатов реакции агглютинации.

4. Постановка реакции преципитации для выявления антигена бактерий.

5. Оценка результатов реакции преципитации.

6. Оценка результатов реакции непрямой гемагглютинации.

7. Оформление протокола.

Литература:

1. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и имму-нологией.– Киев: Высшая школа, 1992.- 431с.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиоло-гия.- М.: Медицина, 1998.- 336с.

3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.П. Покровского.– М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.– 768с.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммуноло-гия и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с.

5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.- 2-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1983.- 512с.

6. Конспект лекции.

Дополнительная литература:

1. Титов М.В. Инфекционные болезни.- К., 1995.– 321с.

2. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.– М.: Медицина, 1990.- 559с.

Реакция агглютинации.

Реакция агглютинации – это склеивание и выпадение в осадок микробных или других клеток (эритроцитов) под действием антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен агглютинации) – образование осадка, который называется агглютинатом.

Эту реакцию используют для серодиагностики и сероидентификации . РА используют для серодиагностики (обнаружение антител в сыворотке крови больных) брюшного тифа и паратифа (реакция Видаля), бруцеллеза (реакция Райта), туляремии и лептоспироза . РА используют для сероидентификации (определения вида возбудителя, выделенного от больного) при кишечных инфекциях, коклюше, холере и др.

Компоненты реакции:

1. Антиген (агглютиноген) – это целые (не разрушенные) микробные или другие клетки (корпускулярный , нерастворимый антиген ). Агглютиногены – это взвесь живых или убитых микробных клеток или других каких-либо клеток. Антигены могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестный агглютиноген – это микробная культура, выделенная из организма больного, которую необходимо определить. Известный антиген – диагностикум – диагностический препарат - взвесь убитых микробов известного вида в физиологическом растворе. Эта взвесь мутная (непрозрачная ), т.к. микробные клетки не растворяются, а остаются целыми. Известный агглютиноген будет использоваться для обнаружения неизвестных антител в сыворотке крови больных.

2. Антитело (агглютинин) – находится в сыворотке крови. Антитела также могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестные антитела, которые нужно определить, находятся в сыворотке крови больного человека . Известные антитела находятся в иммунных диагностических сыворотках , которые называются агглютинирующими сыворотками . Они используются для сероидентификации, т.е. для определения неизвестного антигена – вида микробной культуры.

3. Электролит – 0,9% раствор хлорида натрия.

Способы постановки РА.

1. Ориентировочная (пластинчатая) РА – проводится на стекле. На предметное стекло наносят 2 капли сыворотки и 1 каплю изотонического раствора. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора петлей вносят микробную культуру и перемешивают. Капля изотонического раствора с микробами – контроль антигена , капля сыворотки без микробов – контроль антитела , капля сыворотки с микробами – опыт. Если в сыворотке имеются антитела, соответствующие микробным антигенам, которые с ней смешиваются, то антитела и антигены будут специфически связываться друг с другом и через 1 – 3 мин в опытной капле появятся хлопья агглютината. Контроль антигена должен быть мутным, а контроль антитела – прозрачным. Учет результатов реакции проводится по появлению хлопьев агглютината . Если выпадают хлопья – реакция положительна, т.е. антиген соответствует антителу и по антигену можно определить антитело или наоборот. Если остается помутнение – реакция отрицательная.

2. Развернутая реакция агглютинации – проводится в пробирках. Вначале готовят 2-хкратные разведения сыворотки крови больного человека от 1:50 до 1:1600. В 6 пробирок наливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую пробирку вносят 1 мл сыворотки крови больного в разведении 1:50, перемешивают и получают разведение 1:100, затем 1 мл разведения 1:100 переносят во вторую пробирку и получают разведение 1:200 и т.д. Две пробирки оставляют для контроля антигена и сыворотки. В контроль сыворотки добавляют только сыворотку в разведении 1:50, в контроль антигена – только антиген. Во все остальные пробирки добавляют 0,1 мл антигена - диагностикума (О- или Н-) и ставят все пробирки в термостат при 37°С на 18-20 часов. Учет результатов реакции проводят по характеру, количеству образовавшегося осадка (агглютината) и степени мутности. Учет проводят только при следующих результатах в контролях: контроль сыворотки – прозрачный, контроль антигена – мутный. О-антитела дают мелкозернистый осадок. Н-антитела – крупнозернистый. По последней пробирке, в которой еще видна реакция агглютинации, устанавливают диагностический титр.

При серодиагностике заболеваний важно не просто обнаружить специфические антитела к определенному возбудителю, но и выявить их количество, т.е. установить такой титр антител, когда можно говорить о наличии заболевания, вызванного этим возбудителем. Этот титр и называется диагностическим титром. Например, для диагностики брюшного тифа нужно выявить титр антител – 1:400, но не меньше. Еще более точные результаты дает выявление нарастания антител в парных сыворотках.Сыворотку больного отбирают в начале заболевания и через 3 – 5 или более дней. Если титр антител возрастает не менее, чем в 4 раза, следовательно, можно говорить о текущем заболевании.

ИММУНОМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунологические методы применяют для решения многих задач:

1. Оценка состояния иммунной системы человека (иммунного статуса) по определению количественных и функциональных характеристик клеток иммунной системы и их продуктов.

2. Определение состава и характеристик тканей человека: групп крови, резус фактора, трансплантационных антигенов.

3. Диагностика инфекционных болезней и резистентности к ним по обнаружению и установлению титров антител (серодиагностика), выявлению антигенов возбудителей в организме, определению клеточных реакций на эти антигены.

4. Сероидентификация культур бактерий и вирусов, выделенных из организма человека и животных.

5. Выявление в организме человека и во внешней среде любых веществ, обладающих антигенными или гаптенными свойствами (гормоны, ферменты, яды, лекарства, наркотики и т.п.).

6. Выявление иммунопатологических состояний, аллергий, трансплантационных и противоопухолевых реакций.

Процесс взаимодействия антигена и антитела в серологических реакциях протекает в две фазы:

1) специфическая - фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител (паратопов) и эпитопов антигена. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут;

2) неспецифическая - фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов. Эта фаза может развиваться от нескольких минут до нескольких часов.

Оптимальное специфическое взаимодействие антител с антигеном происходит в изотоническом растворе с рН, близким к нейтральному. Реакция антиген-антитело в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов

· агглютинации,

· преципитации,

· лизиса.

Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств антигена (размер частиц, физическое состояние), класса и вида антител (полные и неполные), а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, рН, температура).

Поливалентность антигенов и антител обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит в соответствии с теорией образования сетей, согласно которой к образовавшемуся комплексу антиген-антитело последовательно присоединяются другие молекулы антител и антигена. В результате формируются сетевые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Характер и выраженность реакции зависят от количественного соотношения антигенов и антител. Наиболее интенсивно реакции проявляются в том случае, если реагенты находятся в эквивалентном соотношении.

Необходимое условие образование решетки (сетей) - наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антигена и по два активных центра на каждую молекулу антитела. Молекулы антигена являются узлами решетки, а молекулы антител - связующими звеньями. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности) концентраций антигена и антител, когда в надосадочной жидкости после образования осадка не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела.

Агрегаты, способные выпадать в осадок, образуются при соединении антигенов с полными антителами. Неполные антитела (моновалентные) не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Для выявления таких антител используют специальные методы, основанные на использовании антиглобулинов (реакцию Кумбса).

Серологические реакции, благодаря высокой специфичности и чувствительности, применяют для выявления и количественного определения антигенов и антител. Количество иммунореагентов в реакциях выражают титром - максимальным разведением сыворотки или антигена, при котором еще наблюдается реакция.

Серологические реакции в микробиологических и иммунологических лабораториях используют в двух целях:

1) для сероидентификации микроорганизмов, токсинов, антигена вообще с помощью известного антитела (иммунной диагностической сыворотки),

2) для серодиагностики - определения природы антитела в сыворотке крови больного при бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваниях с помощью известного антигена (диагностикума).

Для определения родовой, видовой и типовой принадлежности антигена необходимы заведомо известные иммунные диагностические сыворотки. Их получают путем многократного введения животным (чаще кроликам) в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов, продуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов. После определенного цикла иммунизации животных делают массивное кровопускание или тотальное обескровливание животного. Кровь, собранную в стерильную посуду, сначала помещают в термостат при температуре 37°С на 4 - 6 ч для ускорения свертывания, затем - в ледник на сутки. Полученную прозрачную сыворотку отсасывают в стерильную посуду, добавляют консерванты, определяют титр антител, проверяют на стерильность и разливают в ампулы.

Используются неадсорбированные и адсорбированные диагностические сыворотки. Неадсорбированные сыворотки обладают высокими титрами антител, но способны давать групповые (перекрестные) реакции.

Адсорбированныесыворотки отличаются строгой специфичностью действия (реагируют только с гомологичным антигеном). Сыворотки, содержащие антитела только к одному определенному антигену называются монорецепторными.

Выпускают также сыворотки, меченные флюорохромами, ферментами, радиоизотопами, которые позволяют с высокой степенью точности обнаружить даже следы антигена.

В качестве антигенов (диагностикумы) в серологических реакциях применяют взвеси живых или убитых бактерий, продуктов их расщепления, токсины, вирусы. В ряде случаев используют экстракты или выделенные химическим путем антигены из микроорганизмов и тканей животных.

Все иммуномикробиологические методы можно разделить на 3 группы :

1) основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.);

2) основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др.);

3) с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы и другие методы).

РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген);

2) антитело (агглютинин)

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

Ориентировочная реакция агглютинации (РА)

Ориентировочная, или пластинчатая, РА ставится на предметном стекле при комнатной температуре. Для этого пастеровской пипеткой на стекло наносят раздельно каплю сыворотки в разведении 1:10 - 1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида. В ту и другую бактериологической петлей вносят колонии или суточную культуру бактерий (каплю диагностикума) и тщательно перемешивают их. Реакции учитывают через несколько минут визуально, иногда с помощью лупы (х5). При положительной РА в капле с сывороткой отмечают появление крупных и мелких хлопьев, при отрицательной - сыворотка остается равномерно мутной.

Развернутая реакция агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий.

В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).

За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)