Современные методы диагностики вич-инфекции. Использование теста комбибест в диагностике вич Общая информация об исследовании

Наибольшее распространение сегодня в мире получил СПИД - вирус из подсемейства ретровирусов, их называют еще лентивирусами, или «медленными». Действительно, в организме человека они начинают проявлять активность по прошествии сравнительно длительного времени, приблизительно лет через 10.

Существует иммунодефицит первого и второго типа. Но смело можно говорить об экспансии вируса первого типа. Попав в кровь и присоединившись к клетке, которая отвечает за иммунитет, вирус начинает быстро размножаться. Пока молекула СD4, отвечающая за его распознание, идентифицирует коварного врага, он успевает заразить весь организм. Поэтому чем раньше его диагностировать, тем больше шансов у больного получить своевременное лечение и дольше прожить.

Если у человека есть повод проверить себя на СПИД, сделать это следует незамедлительно. Чаще всего основа такой диагностики - определение в крови антител к иммунодефициту - белков, возникающих как реакция на присутствие вируса, а начинают они образовываться в период от 1,5 до 6 месяцев со времени возможного заражения. Соответственно и пройти диагностику целесообразнее по истечении этого периода.

Определяется количество антител, используя анализ, получивший название иммуноферментного (ИФА). Этому методу доверяют, он сравнительно точный и высокочувствительный, эти показатели составляют свыше 99, 5%. Фармацевтический рынок предлагает ряд наборов диагностических тестов для ИФА: Комбибест ВИЧ, Анти-ВИЧ 1 2, КомбиБест анти-ВИЧ, КомбиБест анти - ВИЧ 1 2, КомбиБест анти-ВИЧ 1 2 d 0172. Эти тест-системы принадлежат к третьему поколению. Недостаток указанных реагентов: они не всегда выявляют болезнь в ранние сроки. Человек уже вирусоноситель, он потенциально опасен для партнеров, но антитела в крови еще не присутствуют.

Наборы в основном оснащены количеством тестов для проведения 12*8 или 192 анти - ВИЧ анализов. Самостоятельно пользоваться ими не рекомендуется. В описании препаратов указывается, что их главное предназначение - выявить количество антител к СПИДу обоих типов. А также определить антитела всех классов к СПИДу. Если антител нет, значит, болезнь не диагностирована.

Четвертое поколение тестов «видит», кроме антител, и антигены СПИДа, они способны обнаружить инфицирование раньше, чем средства третьего поколения. Для сравнения: антиген ВИЧ есть в крови, начиная уже с 5-х суток, а первые антитела появляются не ранее, чем через месяц. КомбиБест ВИЧ 1, 2 АГ/АТ (комплект 1) и КомбиБест ВИЧ 1, 2 АГ/АТ (комплект 2) принадлежат к тестам 4-го поколения. Воспользовавшись набором этих реагентов, выявляют антитела к типу 1, 2 и антиген р24 , исследуя сыворотку или плазму человеческой крови. Многие страны применяют ИФА тестирование именно 4 поколения, которое носит еще и название Антиген/Антитело, сокращенно - АГАТ.

Проводится тестирование анонимно.

Своевременная диагностика ВИЧ-инфекции становится крайне важной мерой, т. к. ранее начало лечения может во многом предопределить дальнейшее развитие заболевания и продлить жизнь больного . В последние годы наблюдается весомый прогресс в области выявления этой страшной болезни: на смену старым тест-системам приходят более совершенные, методы обследования становятся более доступными, и их точность значительно повышается.

В данной статье расскажем о современных методах диагностики ВИЧ-инфекции, знать которые полезно для своевременного лечения данной проблемы и поддержания нормального качества жизни заболевшего.

Методики диагностики ВИЧ

В России для диагностики ВИЧ-инфекции проводится стандартная процедура, включающая в себя два уровня:

• ИФА тест- система (скрининговый анализ);
• иммунный блоттинг (ИБ).

Также для диагностики могут применяться другие методики:

• экспресс-тесты.

ИФА тест-системы

На первом этапе диагностики для выявления ВИЧ-инфекции применяется скрининговый тест (ИФА), который основан на созданных в лабораториях белках ВИЧ, улавливающих вырабатывающиеся в организме в ответ на инфицирование специфические антитела. После их взаимодействия с реагентами (ферментами) тест-системы изменяется окраска индикатора. Далее эти изменения цвета обрабатываются на специальной аппаратуре, которая и определяет результат выполненного анализа.

Такие ИФА-тесты способны показывать результат уже через несколько недель после внедрения ВИЧ-инфекции. Этот анализ определяет не наличие вируса, а выявляет выработку антител к нему. Иногда, в организме человека выработка антител к ВИЧ начинается через 2 недели поле заражения, но у большинства людей они вырабатываются на более поздних сроках, спустя 3-6 недель.

Существует четыре поколения ИФА-тестов с различной чувствительностью. В последние годы чаще применяются тест-системы III и IV поколения, которые созданы на основе синтетических пептидов или рекомбинантных белков и обладают большей специфичностью и точностью. Они могут использоваться для диагностики ВИЧ-инфекции, мониторинга распространенности ВИЧ и обеспечения безопасности при проверке донорской крови. Точность ИФА-тест-систем III и IV поколения составляет 93-99% (более чувствительны тесты, которые выпускаются в странах западной Европы – 99%).

Для выполнения ИФА-теста проводится забор 5 мл крови из вены пациента. Между последним приемом пищи и анализом должно пройти не менее 8 часов (как правило, он выполняется утром натощак). Такой тест рекомендуется сдавать не ранее, чем через 3 недели после предполагаемого заражения (например, после незащищенного полового акта с новым половым партнером).

Результаты ИФА-теста получаются через 2-10 дней:

• отрицательный результат: указывает на отсутствие инфицирования ВИЧ и не требует обращения к специалисту;
• ложноотрицательный результат: может наблюдаться на ранних сроках инфицирования (до 3 недель), при поздних стадиях СПИДа при выраженном подавлении иммунитета и при неправильно проведенной подготовке крови;
• ложноположительный результат: может наблюдаться при некоторых заболеваниях и при неправильно проведенной подготовке крови;
• положительный результат: указывает на заражение ВИЧ инфекцией, требует проведения ИБ и обращения пациента к специалисту в центр СПИДа.

Почему ИФА-тест может давать ложноположительные результаты?

Ложноположительные результаты ИФА-теста на ВИЧ могут наблюдаться при неправильной обработке крови или у больных с такими состояниями и заболеваниями:

• множественная миелома;
• инфекционные заболевания, спровоцированные вирусом Эпштейна-Барр;
• состояние после ;
• аутоиммунные заболевания;
• на фоне беременности;
• состояние после вакцинации.

При вышеописанных причинах в крови могут присутствовать неспецифические перекрестно реагирующие антитела, выработка которых была спровоцирована не ВИЧ-инфекцией.

В последние годы частота ложноположительных результатов существенно снизилась благодаря применению тест-систем III и IV поколения, которые содержат более чувствительные пептидные и рекомбинантные белки (они синтезируются при помощи генной инженерии in vitro). После начала применения таких ИФА-тестов частота ложноположительных результатов значительно снизилась и составляет около 0,02-0,5%.

Выявление ложноположительного результата не означает, что человек инфицирован ВИЧ. В таких случаях ВОЗ рекомендует провести еще один ИФА-тест (обязательно IV поколения).

Кровь пациента отправляется в референс или арбитражную лабораторию с пометкой «повторить» и исследуется на ИФА тест-системе IV поколения. Если результат нового анализа отрицательный, то первый результат признается ошибочным (ложноположительным) и ИБ не проводится. При положительном или сомнительном результате во время второго теста больному обязательно назначается проведение ИБ через 4-6 недель для подтверждения или опровержения ВИЧ-инфицирования.

Иммунный блоттинг

Окончательный диагноз инфицирования ВИЧ может устанавливаться только после получения положительного результата иммунного блоттинга (ИБ). Для его проведения применяется нитроцеллюлозная полоска, на которую нанесены вирусные белки.

Забор крови для ИБ выполняется из вены. Далее она подвергается специальной обработке и содержащиеся в ее сыворотке белки разделяют в специальном геле по их заряду и молекулярной массе (манипуляция проводится на специальной аппаратуре под воздействием электрического поля). На гель из сыворотки крови накладывают нитроцеллюлозную полоску и проводят блоттинг («промакивание») в специальной камере. Полоска обрабатывается и если в используемых материалах есть антитела к ВИЧ, то они связываются с антигенными полосами на ИБ и проявляются в виде линий.

ИБ считается положительным если:

• по критериям American CDC – на полоске есть две или три линии gp41, p24, gp120/gp160;
• по критериям American FDA – на полоске есть две линии р24, р31 и линия gр41 или gр120/gр160.

В 99,9% случаев положительный результат ИБ указывает на ВИЧ-инфицирование.

При отсутствии линий – ИБ является отрицательным.

При выявлении линий с gр160, gр120 и gр41- ИБ является сомнительным. Такой результат может выявляться при:

• онкологических заболеваниях;
• беременности;
• частых трансфузиях крови.

В таких случаях рекомендуется выполнение повторного исследования при помощи набора другой фирмы. Если же после дополнительного ИБ результат остается сомнительным, то необходимо наблюдение в течение полугода (через каждые 3 месяца проводятся ИБ).

Полимеразная цепная реакция

Тест на ПЦР может определять РНК вируса. Его чувствительность достаточно высока и он позволяет выявлять ВИЧ-инфицирование уже через 10 дней после заражения. В некоторых случаях ПЦР может давать ложноположительные результаты, т. к. его высокая чувствительность может реагировать и на антитела к другим инфекциям.

Данная методика диагностики является дорогостоящей, требует специального оборудования и высокой квалификации специалистов. Эти причины не дают возможности проводить ее при массовом тестировании населения.

ПЦР применяется в таких случаях:

• для выявления ВИЧ у новорожденных, которые родились от ВИЧ-инфицированных матерей;
• для выявления ВИЧ в «периоде окна» или при сомнительном ИБ;
• для контроля концентрации ВИЧ в крови;
• для исследования донорской крови.

Только по тесту ПЦР диагноз ВИЧ не ставится, а проводится в качестве дополнительного метода диагностики для разрешения спорных ситуаций.

Экспресс-методы

Одной из инноваций в диагностике ВИЧ стали экспресс-тесты, результаты которых могут оцениваться уже через 10-15 минут. Наиболее эффективные и точные результаты получаются при помощи иммунохроматографических тестах, основанных на принципе капиллярного потока. Они представляют собой специальные полоски, на которые наносится кровь или другие исследуемые жидкости (слюна, моча). При наличии антител к ВИЧ спустя 10-15 минут на тесте появляются цветная и контрольная полоска – положительный результат. При отрицательном результате – появляется только контрольная полоска.

Как и после тестов ИФА, результаты экспресс-тестов должны подтверждаться анализом ИБ. Только после этого может ставиться диагноз о ВИЧ-инфицировании.

Существуют экспресс-наборы для домашнего тестирования. Тест OraSure Technologies1 (США) одобрен FDA, продается без рецепта и может применяться для выявления ВИЧ. После проведения теста, в случае положительного результата, больному рекомендуется пройти обследование в специализированном центре для подтверждения диагноза.

Остальные тесты для домашнего использования еще не были одобрены FDA и их результат может быть очень сомнительным.

Несмотря на то, что экспресс-тесты по своей точности уступают ИФА-тестам IV поколения, они широко применяются для дополнительного тестирования населения.

Сдать анализы на выявление ВИЧ-инфекции можно в любой поликлинике, ЦРБ или в специализированных СПИД-центрах. На территории России они проводятся абсолютно конфиденциально, или анонимно. Каждый пациент может рассчитывать на получение медицинской или психологической консультации до или после проведения анализа. Платить за тесты на ВИЧ придется только в коммерческих лечебных учреждениях, а в государственных поликлиниках и больницах они выполняются бесплатно.

О том, какими путями можно заразиться ВИЧ-инфекцией и какие мифы существуют о возможностях заразиться, читайте в

В настоящем сообщении представлены результаты определения антител к ВИЧ в сыворотке крови 40 823 человек, в число которых входили пациенты женских консультаций, поликлиник, больниц города, а также медицинских центров, специализирующихся на обследовании и лечении больных групп риска (наркоманы, пациенты с вирусными гепатитами В, С и венерическими заболеваниями). Исследования были проведены в 2005 году в лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, обладающей более чем 15-лет-ним опытом применения методов ИФА для диагностики различных инфекционных заболеваний.

Для первичного обследования образцов сыворотки крови использовали тест-систему “КомбиБест анти-ВИЧ-1+2” (ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибирск), выявляющую в обследуемых образцах сыворотки или плазмы крови человека суммарные специфические антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (иммуноглобулины классов A, G и M). В данном диагностическом наборе рекомбинантные белки ВИЧ применяются как для иммобилизации в лунки планшетов, так и в виде конъюгата с пероксидазой хрена. Оценку результатов анализа сывороток проводили в соответствии с рекомендациями инструкции к тест-системе: негативными (не содержащими антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2) считали тестируемые пробы, оптическая плотность (ОП) которых в ИФА не превышала значение ОПкрит.

При проведении скрининга в лаборатории для 40222 (98,5%) из 40823 образцов сыворотки был получен отрицательный результат ИФА, а 601 (1,5%) исследованная проба была расценена как первично положительная. В результате проведенного на следующий день повторного анализа каждой из 601 сыворотки в дублях (двух лунках планшета) 440 (73,2%) образцов были определены как положительные, а 161 (26,8%) – как отрицательные. В соответствии с рекомендациями Министерства здравоохранения и социального развития 440 положительных в скрининге сывороток были заморожены и переданы для дополнительных подтверждающих исследований в консультационно-диагностический кабинет референс-лаборатории больницы № 30 им. С.П. Бот-кина. Эти исследования были проведены с использованием иммуноферментных тест-систем “ЭКОлаб-Вироностика ВИЧ 1,2 Аг/Ат” (“ЭКОлаб”, Электрогорск), “Genscreen Plus HIV Ag-Ab” (“БиоРад”, США), а также наборов для иммуноблота. Результаты анализа 440 сывороток в подтверждающих тестах позволили сделать заключение, что 323 (73,4 %) образца являются положительными, а 102 (23,2%) – отрицательными. Для 15 исследованных проб (3,4%) был получен неопределенный результат анализа.

Следует отметить, что значения ОП, полученные в нашей лаборатории при их первичном тестировании с использованием тест-системы “КомбиБест анти-ВИЧ-1+2”, для 314 (97,2%) из этих 323 положительных сывороток составляли от 0,900 до 1,780, а для 9 (2,8%) образцов – 0,500–0,900. Величины ОП, полученные при скрининге 102 отрицательных сывороток, для 52 образцов (51%) находились в интервале от 0,195 до 0,400; для 40 (39,2%) проб – 0,401–0,800; 10 (9,8 %) образцов – более 0,800.

Таким образом, в результате проведенной работы показано, что первичное обследование сывороток крови на наличие серологических маркёров ВИЧ-инфекции с использованием тест-системы “КомбиБест анти-ВИЧ-1+2” является высокоэффективным. Положительные результаты скрининга подтвердились при проведении дополнительных исследований в референс-лаборатории в 73% случаев, а ложноположительные – зарегистрированы только для 0,25% из 40 823 проанализированных сывороток.

Описание

Подготовка

Показания

Интерпретация результатов

Описание

Метод определения Иммуноферментный анализ (ИФА).

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Комбинированное выявление антител к ВИЧ типов 1 и 2 и антигена р24 ВИЧ, качественный тест.

Внимание. При положительных и сомнительных реакциях, срок выдачи результата может быть увеличен до 10-ти рабочих дней. ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), вызывающий СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) - принадлежит к семейству ретровирусов. Передается от человека к человеку при использовании загрязненных игл и шприцев для внутривенного введения наркотиков или терапевтических процедур, при сексуальных контактах, как гетеро, так и гомосексуальных. Передача вируса может произойти при переливании инфицированной крови и ее продуктов, донорстве органов или семенной жидкости, у медицинских работников - при ранении инфицированными иглами или инструментами. Заражение ВИЧ возможно путем его передачи от инфицированной матери ребенку (вертикальный путь), хотя современные методы профилактики с применением антиретровирусной терапии, при выполнении всех рекомендаций, позволяют снизить такой риск до минимума.

Процесс взаимодействия вируса с клеткой включает ряд стадий: связывание вируса с клеткой, освобождение его от оболочки, проникновение в цитоплазму, синтез ДНК по вирусной РНК, встраивание вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. После этого начинается латентная стадия инфекции. В таком состоянии провирусная ДНК может существовать некоторое время, не проявляя активности и не влияя на жизнедеятельность клетки-хозяина. Пока нет экспрессии вирусных белков, нет и иммунного ответа на вирус. Антитела к ВИЧ, характеризующие иммунный ответ организма, появляются после активации вирусной ДНК и начала активного размножения вируса. Длительность латентного периода зависит от ряда факторов, включая и индивидуальные генетические особенности организма.

Антитела к ВИЧ могут появиться, начиная со второй недели после инфицирования; их содержание увеличивается в течение 2-4-х недель и сохраняется на протяжении многих лет. У 90-95% инфицированных они появляются в первые три месяца после заражения, у 5-9% - в период от трех до шести месяцев, у 0,5-1% – в более поздние сроки.

В первые недели инфекции, еще до появления антител к вирусу (т.е. до сероконверсии), в образцах сыворотки или плазмы можно выявить присутствие антигенов ВИЧ, в том числе его капсидного белка р24. Позже, после сероконверсии, он обычно становится недетектируемым.

Комбинированные тест-системы 4-го поколения, к которым относится тест HIV Ag/Ab Combo (Architect, Abbott), выявляют как антитела к ВИЧ 1 и 2 типов, так и антиген р24 ВИЧ, что позволяет проводить раннее обнаружение инфекции. К особым характеристикам применяемого в лаборатории ИНВИТРО скринингового теста для выявления ВИЧ-инфекции стоит отнести высокую специфичность исследования (> 99,5%); 100% чувствительность анализа к антителам, характерным для периода сероконверсии, и чувствительность теста к антигену р24 порядка 18 пг/мл.

Порядок проведения лабораторного обследования на ВИЧ строго регламентирован приказами МЗ РФ и включает в себя этап скринингового (отборочного) исследования наличия антител к ВИЧ иммуноферментными (ИФА) методами, разрешенными к использованию, и этап верификационного (подтверждающего) более развернутого исследования в лаборатории городского центра СПИД. Следует отметить, что даже лучшие скрининговые ИФА-системы не гарантируют 100% специфичности, то есть существует некоторая вероятность получения неспецифических, ложноположительных результатов, связанных с особенностями сыворотки крови пациента. Поэтому положительный результат скринингового ИФА обследования может не подтвердиться в подтверждающих тестах, после чего пациенту выдадут отрицательный или неопределенный результат. При неопределенном результате подтверждающего исследования тестирование следует повторить в динамике через 2-3 недели.

Лабораторная диагностика ВИЧ инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, имеет свои особенности. В их крови до 18-ти месяцев с момента рождения могут циркулировать материнские антитела к ВИЧ (класса IgG). Отсутствие антител к ВИЧ у новорожденных не означает, что вирус не проник через плацентарный барьер. Дети ВИЧ-инфицированных матерей подлежат лабораторно-диагностическому обследованию в течение 36-ти месяцев после рождения.

Подготовка

Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи. С общими рекомендациями для подготовки к исследованиям можно ознакомиться . Целесообразно проводить исследование на обнаружение антигена и антител к ВИЧ не раньше, чем через две недели после возможного инфицирования, с повторением его через три и шесть недель в случае отрицательного результата. Оформление заявок для проведения исследований в ООО «ИНВИТРО» осуществляется по паспорту или документу, его заменяющему (миграционная карта, временная регистрация по месту жительства, удостоверение военнослужащего, справка из паспортного стола при утере паспорта, регистрационная карта учёта из гостиницы). Предъявленный документ в обязательном порядке должен содержать информацию о временной или постоянной регистрации на территории РФ и фотографию. При отсутствии паспорта (документа его заменяющего) пациент вправе оформить анонимную заявку для сдачи биоматериала. При анонимном обследовании, заявке и полученному от клиента образцу биоматериала присваивается номер, известный только пациенту, и медперсоналу, оформлявшему заказ. ! Результаты исследований, выполненных анонимно, не могут быть представлены для госпитализации, профессиональных осмотров и не подлежат регистрации в ОРУИБ.

Показания к назначению

• Увеличение лимфатических узлов более двух областей.
• Лейкопения с лимфопенией.
• Ночная потливость.
• Резкое похудание неясной причины.
• Диарея более трех недель неясной причины.
• Лихорадка неясной причины.
• Планирование беременности.
• Предоперационная подготовка, госпитализация.
• Выявление следующих инфекций или их сочетаний: туберкулез, манифестный токсоплазмоз, часто рецидивирующая герпесвирусная инфекция, кандидоз внутренних органов, повторные невралгии герпес-zoster, вызванная микоплазмами, пневмоцистой или легионеллами пневмония.
• Саркома Капоши в молодом возрасте.
• Случайные половые контакты.

Интерпретация результатов

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения в Независимой лаборатории ИНВИТРО: тест качественный. Форма представления результатов: при отсутствии антител к ВИЧ 1 и 2 и антигена р24 выдается ответ «отрицательно». В случае обнаружения антител к ВИЧ или антигена в скрининговом иммуноферментном тесте пробу сыворотки отправляют для исследования подтверждающим методом иммуноблота в городской центр СПИД, который верифицирует положительные и неопределенные результаты.

Положительный результат:

1. ВИЧ - инфекция;
2. ложноположительный результат, требующий повторных или дополнительных исследований*);
3. исследование неинформативно у детей до 18 мес, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.

*Специфичность скрининговой тест-системы Антитела к ВИЧ 1 и 2 и антиген ВИЧ 1 и 2 (HIV Ag/Ab Combo, Abbott), по оценкам, представленным производителем реагентов, составляет около 99,6% как в общей популяции, так и в группе пациентов с потенциальными интерференциями (инфекции HBV,HCV, Rubella, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E.coli, Chl.trach. и др., аутоиммунные патологии (включая ревматоидный артрит, присутствие антинуклеарных антител), беременность, повышенный уровень IgG, IgM, моноклональные гаммапатии, гемодиализ, множественные гемотрансфузии).