Анализ кумбса. Пробы кумбса

Проба Кумбса - это специфический лабораторный тест, который позволяет определить антитела, находящиеся в или на поверхности эритроцита. Данная процедура позволяет диагностировать иммунную в том числе у новорожденных, а также выявить гемолитические трансфузионные реакции. Проба Кумбса активно применяется в судебной медицине и научной генетике с целью определения эритроцитарных антигенов. Соблюдение всех правил осуществления такого анализа позволяет получить максимально достоверный результат.

Цель антиглобулинового теста

Проба Кумбса прямая позволяет обнаружить антиэритроцитарные антитела, которые фиксируются на эритроцитах. Положительная реакция при подобном исследовании указывает на развитие аутоиммунной Следует отметить, что отрицательный результат не исключает наличия поскольку антитела нередко находятся в свободном виде, то есть не имеют связи с эритроцитами. В таких случаях целесообразно провести непрямую пробу Кумбса, которая позволит определить автономные вещества в

Как проводится анализ?

абор венозной крови у пациента осуществляют утром натощак, несмотря на то, что каких-либо существенных факторов, влияющих на конечный результат подобного теста, не обнаружено. Хранить взятый материал разрешается при температуре от 2 до 8 °С не дольше семи дней. Для того чтобы показатели данного исследования были максимально точны, цельную кровь в течение первых двух часов необходимо доставить в лабораторию. В идеале проба Кумбса должна показывать отрицательный результат, что указывает на отсутствие гемолитических изменений в организме.

Расшифровка итоговых показателей

Проба Кумбса является достаточно трудоемким методом исследования, который требует тщательного и точного выполнения. При использовании такого теста могут встречаться некоторые сложности, которые связаны с неправильной интерпретацией окончательных результатов по причине слабого проявления положительных реакций. Следует отметить, что недостоверность анализа - а именно положительная проба Кумбса - может стать следствием неэффективной отмывки эритроцитов, контакта с жирной
поверхностью, а также нейтрализации антиглобулиновых реагентов компонентами

сыворотки. Еще одним недостатком такого метода исследования является нестойкость взятого материала, хранение которого имеет определенные особенности.

Причиной ложноотрицательного результата может стать чрезмерное встряхивание взвеси эритроцитов при ресуспендировании. Ошибочные результаты могут быть также обусловлены присутствием примесей антикомплементарных антител, которые адсорбируются при инкубации на поверхности тестируемых эритроцитов, в результате чего создается видимость положительного результата. Если тщательно отмывать исследуемые образцы и контролировать условия проведения реакции, указанные недостатки могут быть легко устранены, что повысит шансы на получение максимально достоверных показателей пробы Кумбса.

Прямая проба Кумбса . С помощью этой пробы доказывают наличие фиксированных эритроцитами ребенка блокирующих антител. Положительная прямая проба свидетельствует о сенсибилизации и служит убедительным признаком гемолитической болезни новорожденного еще до появления других клинических признаков. Как исключение и только в очень тяжелых случаях прямая проба Кумбса может оказаться отрицательной в связи с уже наступившим, почти полным гемолизом сенсибилизированных эритроцитов.

Прямая проба Кумбса выполняется следующим образом: 5 капель крови, взятой из пятки ребенка, помещают в пробирку и добавляют 5 мл физиологического раствора. Хорошо размешивают и центрифигуриуют в течение 10 мин. Отделяют прозрачную жидкость над осадком эритроцитов. Затем снова добавляют 5 мл физиологического раствора, смешивают и центрифигурируют. После трехкратного смешивания с физиологическим раствором эритроциты хорошо промыты. После последнего отделения надосадочной жидкости эритроцитный осадок в количестве 0,1 мл смешивают с 0,9 мл физиологического раствора. Наносят 2-3 капли этой смеси на предметное стекло и добавляют одну каплю сыворотки Кумбса. Наличие агглютинации указывает на то, что реакция положительна, (положительная прямая проба Кумбса). Исследование следует проводить при комнатной температуре выше 16°, чтобы избежать действия Холодовых агглютининов.

Непрямая проба Кумбса служит доказательством наличия свободных антител в сыворотке матери и выполняется с сывороткой крови матери.

Гемолитическая болезнь у новорожденного при Rh-несовместимости проявляется обыкновенно после второй беременности. Первый ребенок рождается здоровым, второй с признаками слабо выраженной анемии и только после третьей беременности рождаются дети с явными признаками гемолитической болезни. Только у предварительно сенсибилизированных женщин еще при первой беременности может родиться ребенок с симптомами гемолитической болезни. В некоторых случаях иммунизация вызывает аборты и рождение мертвых детей. Для начала и тяжести заболевания имеют значение состояние плаценты и продолжительность воздействия материнских агглютининов на плод. При появлении агглютининов за 10-14 недель до родов у ребенка обычно наблюдаются субклинические формы. Раннее появление агглютининов, за 15-26 недель до родов, вызывает тяжелые формы заболевания. При всех формах заболевания основным процессом является гемолиз. Последствие реакции антиген - антитело - гемолиз, поражение печеночных и мозговых капилляров. В зависимости от того, какое поражение преобладает, наблюдаются и различные формы заболевания. Опасны и некоторые анафилактические явления. Они приводят к образованию гистаминоподобных субстанций, вызывающих тяжелейшие поражения печеночной клетки и особенно ганглионарных клеток базальных ядер, аммонового рога, продолговатого мозга и даже коры головного мозга. При поражении печеночных клеток к экстрагепатальной желтухе добавляется и гепатальная. Дети погибают при тяжелых явлениях ядерной желтухи. Если они выживают, остаются симптомы поражений нервной системы (нарушения со стороны экстрапирамидальной системы с хореоатетозными движениями, своеобразной танцующей походкой, принудительными движениями головы, иногда расстройство координации произвольных движений с частым падением, повышенным тонусом мышц, умственной отсталостью, т. е. с признаками так наз. encephalopathia posticteria infantum).

На поверхности эритроцитов находится большое количество антигенов. В зависимости от вида этих антигенов выделяют группы крови, самые изученные группы - АВО, Rh, Kell, Duffy и мн...

Средняя цена в вашем регионе: 2645 от 2645 … до 2645

1 лабораторий делают данный анализ в вашем регионе

Описание исследования

Подготовка к исследованию: Кровь берут из вены, а затем получают сыворотку (плазма крови без фибриногена) путем естесственного свертывания или путем осаждения фибриногена. Исследуемый материал: Взятие крови

На поверхности эритроцитов находится большое количество антигенов. В зависимости от вида этих антигенов выделяют группы крови, самые изученные группы - АВО, Rh, Kell, Duffy и многи другие системы. В норме в крови существуют антитела к антигенам другой группы, но при переливании крови, беременности, аутоиммунных заболеваниях и др. обнаруживаются антитела к своим антигенам.Неполные антитела к эритроцитам

Метод

Непрямая реакция Кумбса основана на выявлении агглютинации (слипания) эритроцитов, у которых на поверхности имеются неполные антитела, которая появляется при добавлении антиглобулиновой сыворотки.

На первом этапе в одну пробирку вносят донорские эритроциты (O(I) группа, Rh+) и исследуемую сыворотку. Если неполные антитела к эритроцитам присутствуют в исследуемой сыворотке, то они фиксируются на поверхности донорских эритроцитов.

На втором этапе на стекло наносят донорские эритроциты с антителами (если они были) и стандартную антиглобулиновую сыворотку с антителами к человеческим иммуноглобулинам. Если на первом этапе антитела к эритроцитам зафиксировались на поверхности эритроцитов, то при добавлении стандартной сыворотки эритроциты склеиваются из-за взаимодействие антител.

Референсные значения - норма
(Реакция Кумбса непрямая (антиглобулиновый тест, выявление неполных антиэритроцитарных антител), кровь)

Информация, касающаяся референсных значений показателей, а также сам состав входящих в анализ показателей может несколько отличаться в зависимости от лаборатории!

Норма:

В норме антител к собственным эритроцитам не должно быть, при постановке реакции Кумбса агрегации эритроцитов не происходит.

Показания

Исследование гуморального специфического иммунитета при подозрении на аутоиммунные реакции в организме, резус-конфликт между матерью и плодом, определение совместимости крови донора и реципиента

Повышение значений (положительный результат)

Антитела к эритроцитам обнаруживают при:

1. Аутоиммунных гемолитических анемиях

2. Гемолитической болезни новорожденных

3. Системных заболеваниях соединительной ткани

4. Хроническом активном гепатите и др.

Гемолитическая болезнь новорожденных обычно развивается при несовместимости матери и плода по антигенам систем Rh и AB0, гораздо реже — по антигенам систем Келл, Даффи и MNSs.

1. Гемолитическая болезнь новорожденных, вызванная несовместимостью по антигенам системы Rh . Выработка антител к антигенам системы Rh (в отличие от антител к антигенам системы AB0) происходит только при попадании этого антигена в кровь матери. При нормально протекающей беременности количество эритроцитов плода, проникающих в кровь матери, слишком мало, и иммунизация не происходит. Достаточное для иммунизации количество крови плода может попасть в кровь матери в третьем периоде родов. При первой беременности гемолитическая болезнь новорожденных, вызванная несовместимостью по антигенам системы Rh , возникает только в тех случаях, когда матери раньше переливали кровь, несовместимую по антигенам системы Rh , или она была иммунизирована при амниоцентезе. В отличие от этого, при несовместимости по антигенам системы AB0 гемолитическая болезнь новорожденных может возникнуть даже во время первой беременности, потому что антитела к этим антигенам постоянно присутствуют в крови матери. Чаще всего при гемолитической болезни новорожденных, обусловленной несовместимостью по антигенам системы Rh , вырабатываются антитела к D-антигену. Этот антиген отсутствует примерно у 15% белых и 7% негров. Среди других антигенов системы Rh , которые могут вызвать гемолитическую болезнь новорожденных, можно отметить антигены c и E.

а. Клиническая картина. У плода развивается гемолитическая анемия, которая в тяжелых случаях приводит к сердечной недостаточности, водянке и гибели. Гипербилирубинемия у плода не возникает, так как билирубин свободно проникает через плаценту и попадает в кровь матери. У новорожденного, напротив, наибольшую опасность представляет гипербилирубинемия, поскольку она может привести к билирубиновой энцефалопатии. Иногда наблюдается гепатоспленомегалия. Дифференциальную диагностику проводят с гепатитом, инфекциями, болезнями обмена веществ и геморрагической болезнью новорожденных.

б. Диагностика

1) На ранних сроках беременности определяют групповую (по системам AB0 и Rh ) принадлежность крови беременной и исследуют ее сыворотку на антитела к редким антигенам эритроцитов. Если мать Rh -отрицательна, определяют Rh -принадлежность отца ребенка. Во время беременности регулярно определяют титр антирезусных антител.

2) При появлении антирезусных антител оценивают интенсивность гемолиза. Для этого проводят спектрофотометрический анализ околоплодных вод, полученных при амниоцентезе.

3) При несовместимости по антигенам системы Rh сразу после рождения определяют уровни гемоглобина и билирубина в пуповинной крови.

4) Проводят прямую пробу Кумбса с эритроцитами новорожденного. При положительной пробе определяют, к каким эритроцитарным антигенам направлены антитела. Если в материнской крови антитела к этим антигенам отсутствуют, выясняют, почему прямая проба Кумбса положительна.

в. Лечение во внутриутробном периоде. Раннее интенсивное лечение позволяет снизить риск осложнений.

1) Если титр антирезусных антител у матери превышает 1:8, проводят амниоцентез. Для косвенного определения уровня билирубина и оценки тяжести гемолиза измеряют оптическую плотность околоплодных вод при длине волны 450 нм.

2) Высокая оптическая плотность околоплодных вод в середине и конце беременности свидетельствует о тяжелом гемолизе у плода. В этом случае необходимо провести общий анализ крови плода. Ее получают при кордоцентезе. Снижение гематокрита до 18% и менее служит показанием для внутриутробного переливания эритроцитарной массы Rh -отрицательной крови группы 0. При необходимости переливание эритроцитарной массы повторяют каждые 2—3 нед. Повторные переливания эритроцитарной массы могут частично или полностью подавить эритропоэз у плода.

3) Если развитие плода соответствует гестационному возрасту, на 33—36-й неделе беременности проводят кесарево сечение.

4) Сразу после рождения ребенка определяют его группу крови и проводят прямую пробу Кумбса. После внутриутробного переливания эритроцитарной массы кровь новорожденного может стать Rh -отрицательной.

5) Если прямая проба Кумбса у новорожденного положительна, может потребоваться обменное переливание крови.

г. Лечение новорожденного. При гипербилирубинемии применяют светолечение и обменное переливание крови.

1) Для светолечения используют синий свет, который способствует превращению билирубина в водорастворимые продукты. Светолечение используют в дополнение к обменному переливанию крови — до и после него. Светолечение не должно заменять диагностических мероприятий, направленных на выяснение причин желтухи. Во время светолечения необходимо регулярно определять уровень билирубина в сыворотке, поскольку интенсивность желтухи у новорожденных не соответствует тяжести гемолиза. Чтобы предупредить повреждение сетчатки во время светолечения, глаза ребенка закрывают повязкой.

2) Обменное переливание крови

а) Водянка плода. Проводят обменное переливание крови с однократным замещением ОЦК или переливают эритроцитарную массу.

б) Уровень билирубина более 20 мг% у доношенных и 12—16 мг% у недоношенных — проводят обменное переливание крови с двукратным замещением ОЦК .

3) При анемии (уровень гемоглобина ниже 7—10 г%) после внутриутробного или обменного переливания крови может потребоваться переливание эритроцитарной массы. Эритроциты, покрытые антирезусными антителами, иногда разрушаются медленно, что может привести к анемии в отсутствие гипербилирубинемии через 3—6 нед после рождения.

4) Пассивная иммунизация матери. Риск иммунизации антигенами системы Rh существенно снижается, если Rh -отрицательной матери вводят анти-Rh 0 (D)-иммуноглобулин. Первый раз его назначают в конце II триместра беременности, второй — в первые 72 ч после рождения Rh -положительного ребенка. Анти-Rh 0 (D)-иммуноглобулин необходимо вводить также после аборта и амниоцентеза. Одна ампула анти-Rh 0 (D)-иммуноглобулина (300 мкг) нейтрализует около 15 мл Rh -положительной крови. При подозрении на попадание в кровь матери большего объема крови плода делают мазок по Клейхауэр—Бетке (для выявления эритроцитов плода в крови матери) и вводят соответствующую дозу анти-Rh 0 (D)-иммуноглобулина.

2. Гемолитическая болезнь новорожденных, вызванная несовместимостью по антигенам системы AB0, обычно встречается у детей с группой крови A или B, рожденных матерями с группой крови 0. В сыворотке матери с группой крови 0 присутствуют изогемагглютинины к эритроцитарным антигенам A и B. Предсказать развитие гемолитической болезни новорожденного по титру этих антител у матери нельзя.

а. Клиническая картина. Гемолитическая болезнь может возникнуть даже у ребенка, рожденного от первой беременности. У доношенных тяжелая анемия и водянка встречаются редко. Иногда в первые сутки жизни появляется желтуха, однако гемолиз выражен значительно слабее, чем при несовместимости по антигенам системы Rh .

в. Лечение направлено на снижение гипербилирубинемии. Светолечение снижает потребность в обменном переливании крови, которое в настоящее время проводят лишь у 1 из 3000 новорожденных с гемолитической болезнью, вызванной несовместимостью по антигенам системы AB0. Если необходимо переливание крови, используют эритроцитарную массу группы 0 с низким титром антител к антигенам A и B.

Антитела , находящиеся на поверхности эритроцитов, могут быть как в статичном, так и в свободном состоянии вплазме крови . В зависимости от состояния антител проводится прямая или непрямая реакция Кумбса. Если есть основания для предположения, что антитела зафиксированы на поверхности эритроцитов, проводится прямой тест Кумбса. В этом случае тест проходит в один этап - добавляетсяантиглобулиновая сыворотка . Если на поверхности эритроцитов присутствуют неполные антитела, происходитагглютинация эритроцитов.

Непрямая реакция

Непрямая реакция Кумбса протекает в 2 этапа. Сначала необходимо искусственно осуществить сенсибилизацию эритроцитов. Для этого эритроциты и исследуемую сыворотку крови инкубируют, что вызывает фиксацию антител на поверхности эритроцитов. После чего проводится второй этап теста Кумбса - добавление антиглобулиновой сыворотки.

Реакция преципитации - РП (от лат praecipilo осаждать) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом . Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.

HLA типирование - исследование главного комплекса гистосовместимости человека - HLA комплекса. Это образование включает в себя область генов на 6-й хромосоме, которые кодируют HLA-антигены, участвующие в различных реакциях иммунного ответа.

Задачи при HLA типировании могут стоять самые разные - биологическая идентификация (HLA-тип наследуется вместе с родительскими генами), определение предрасположенности к различным заболеваниям, подбор доноров для пересадки органов - при этом производится сравнение результатов HLA типирования тканей донора и реципиента. С помощью HLA типирования определяют, и насколько супруги сходны или различимы по антигенам тканевой совместимости, чтобы диагностировать случаи бесплодия.

HLA типирование предполагает анализ полиморфизма HLA и проводится двумя методами - серологическим и молекулярно-генетическим. Классический серологический метод HLA типирования основан на микролимфоцитотоксическом тесте, а молекулярный метод использует проведение ПЦР (полимеразную цепную реакцию).

Серологическое HLA типирование проводится на выделенных клеточных популяциях. Антигены главного комплекса гистосовместимости несут на себе в основном лимфоциты. Поэтому суспензию Т лимфоцитов используют в качестве основных носителей антигенов I класса, и суспензию В лимфоцитов для определения антигенов HLA II класса. Для выделения необходимых клеточных популяций из цельной крови используют либо центрифугирование, либо иммуномагнитную сепарацию. Считается, что первый способ может привести к ложноположительным данным, так как при этом происходит гибель части клеток. Второй способ признан более специфичным - при этом более 95% клеток остаются жизнеспособными.

Но основой постановки лимфоцитотоксического теста HLA типирования является специфическая сыворотка, содержащая антитела к различным аллельным вариантам антигенов HLA I и II классов. Серологический тест позволяет определить HLA-тип путем изучения того, какие из сывороток реагируют с лимфоцитами, а какие - нет.

Если между клетками и сывороткой происходит реакция, в результате на поверхности клетки образуется комплекс антиген-антитело. После добавления раствора, содержащего комплемент, происходит лизис и гибель клетки. Оценивают серологический тест HLA типирования с помощью флуоресцентной микроскопии по оценке позитивной (красная флуоресценция) и негативной (зеленая флуоресценция) реакций, или фазово-контрастной микроскопии по окраске ядер погибших клеток. Результат HLA типирования выводят с учетом специфичности прореагировавших сывороток и перекрестно реагирующих групп антигенов, интенсивности реакции цитотоксичности.

Недостатками серологического HLA типирования являются наличие перекрестных реакций, слабое сродство антител или низкая экспрессия HLA-антигенов, отсутствие белковых продуктов у ряда HLA-генов.

Более современные, молекулярные методы HLA типирования используют уже стандартизованные синтетические образцы, которые реагируют не с антигенами на поверхности лейкоцитов, а с ДНК и прямо указывают на то, какие антигены присутствуют в пробе. Молекулярные методы не требуют живых лейкоцитов, любая человеческая клетка может быть подвержена изучению, и для работы достаточно несколько микролитров крови или можно ограничиться соскобом со слизистой оболочки рта.

Молекулярно-генетическое HLA типирование использует метод ПЦР, первым этапом которой является получение чистой геномной ДНК (из цельной крови, лейкоцитарной суспензии, тканей).

Затем образец ДНК копируется - амплифицируется в пробирке с использованием праймеров (коротких одноцепочечных ДНК), специфичных к определенному HLA -локусу. Концы каждого из пары праймеров должны быть строго комплементарны уникальной последовательности, соответствующей конкретному аллелю, в противном случае амплификация не осуществляется.

После ПЦР, в ходе многократного копирования, получается большое количество фрагментов ДНК, которое можно оценить визуально. Для этого реакционные смеси подвергают электролизу или гибридизации, и определяют, произошла ли специфическая амплификация, при помощи программы или таблицы. Результат HLA типирования представляется в форме всестороннего отчета на генном и аллельном уровнях. Из-за стандартизованности используемых образцов, молекулярное HLA типирование точнее серологического. Кроме того, оно дает больше информации (больше новых аллелей ДНК) и более высокий уровень ее детализации, поскольку позволяет идентифицировать не только антигены, но и сами аллели, обуславливающие, какой именно антиген присутствует на клетке.

Реакция иммунного лизиса. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко - реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации Холерных и холероподобных вибрионов).

Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с антителами в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость - «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента.

Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток. Количество клеток, секретирую-щих антитела - гемолизины, определяют по числу бляшек гемолиза, возникающих в агаровом геле, содержащем эритроциты, суспензию клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент.

Иммунофлюоресцентный метод

(РИФ, реакция иммунофлюоресценции) - метод выявления специфических Аг (Ат) с помощью Ат (Аг), конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-д-ки инфекц. заболеваний (идентификация возбудителя в иссл. материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Прямой И. м. состоит в обработке среза ткани или мазка из патологического материала или микробной к-ры с-кой, содержащей специфические Ат, конъюгированные с флюорохромом; препарат промывают для освобождения от несвязанных Ат и рассматривают в люминесцентный микроскоп. В положительных случаях по периферии объекта появляется светящийся иммунный комплекс. Необходим контроль для исключения неспецифического свечения. Принепрямом. И. м. на первом этапе срез ткани или мазок обрабатывают нефлюоресцирующей специфической с-кой, на втором -люминесцирующей с-кой против-глобулинов того животного, с-ка к-рого была применена на первом этапе. В положительном случае образуется светящийся комплекс, состоящий из Аг, Ат к нему и Ат против Ат (сэндвич-метод). Кроме люминесцентного микроскопа для учета РИФ при фенотипировании клеток применяютлазерный сортировщик клеток .

Проточная цитометрия - метод оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).

рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).

интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.